上海桥星生物

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一、胰蛋白酶（trypsin）溶液

    胰蛋白酶是白色或淡黄色粉末，低温干燥保存。主要作用是使细胞间的蛋白质水解，使细胞离散。其活性以其消化酪蛋白的能力进行测定。常用1:250（1:500）方法表示，即1份胰蛋白酶可以消化250份（或500份）酪蛋白。

胰蛋白酶对细胞的分离作用与细胞的类型和细胞的性质关系密切。不同细胞系对胰蛋白酶溶液的浓度、温度和作用时间等的要求也不相同。

    无钙镁离子的平衡盐溶液（常用于配制胰蛋白酶溶液或用于洗涤细胞）

    NaCl    8g

    KCl    0.20g

    KH2PO4    0.02g

    Na2HPO4    0.073g

    葡萄糖    2.00g

    酚红    0.02g

    溶于1000ml水中

    染色体的G带核型实验中胰蛋白酶用生理盐水配制。

二、EDTA溶液

    又称versene，一般用其钠盐，因可溶性较好。有些组织需要Ca2+、Mg2+来保持其完整性，用EDTA来排除这些离子，可使细胞之间裂解，以分散细胞。其作用比胰蛋白酶缓和。使用浓度为0.02%，以无钙、镁的平衡盐溶液配制。

    实验室内常将胰蛋白酶和EDTA联合使用。可提高消化效率，细胞分散情况改善。

EDTA不能被血清抑制，所以消化后必须*清洗。

EDTA对成纤维细胞作用差。

三、胶原酶溶液

    1．用Hank's液配制成2000U/ml

    2．36.5度搅拌溶解1h，4度过YE

    3．滤过消毒

    4．分装成等份使用（1-2周内）

    5．长时间贮存在-20度

四、贴壁细胞——消化法——细胞悬液

    1．吸除或倒掉瓶内培养液。

    2．以25cm2培养瓶为例，向瓶内加入1ml消化液（胰蛋白酶或与EDTA混合液）轻轻摇动培养瓶，使消化液流遍所有细胞表面，然后吸掉或倒掉消化液后再加1ml消化液，轻轻摇动后再倒掉大部分消化液，仅留少许进行消化。也可不采用上述步骤，直接加1-2ml消化液进行消化，但要注意尽量减少消化液的剩余量，因为消化液过多对细胞有损伤，同时也需要较多的含血清培养液去中和。

    3．消化在37度或室温25度环境下进行。消化2-5分钟后把培养瓶放置在显微镜下进行观察，发现胞质回缩、细胞间隙增大后，应立即终止消化。

    4．如仅用胰蛋白酶可直接加含血清的培养液，终止消化。

       如用EDTA消化，需加Hank's液数毫升，轻轻转动培养瓶把残留EDTA消化液冲掉，然后再加培养液，这个操作过程要十分小心，如果细胞已经脱壁则消化液不能够倒掉，以免丢失细胞，要加入Hank's液或培养液终止消化，吹打收集细胞悬液，离心漂洗去除EDTA。

    5．用弯头吸管，吸取瓶内培养液，反复吹打瓶壁细胞，吹打过程要顺序进行，从培养瓶底部一边开始到另一边结束，以确保所有底部都被吹到。吹打时动作要轻柔不要用力过猛，同时尽量不要出现泡沫，这些都对细胞有损伤。细胞脱离瓶壁后形成细胞悬液。